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離心技術(shù)縱橫談

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  高速離心機(jī)是利用物體高速旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生強(qiáng)大的離心力，使置于該旋轉(zhuǎn)體中的懸浮顆粒發(fā)生沉降或漂浮，從而使某些顆粒達(dá)到濃縮或與其他顆粒分離之目的。離心機(jī)的種類(lèi)繁多，用途各異，本章只介紹生物離心機(jī)的基本原理、方法及其在醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)上的應(yīng)用。

  一、第四章  離心技術(shù)離心理論

  1、離心分離的原理

  將處于懸浮狀態(tài)的細(xì)胞、細(xì)胞器、病毒和生物大分子等稱(chēng)為“顆粒”。每個(gè)顆粒都有一定大小、形狀、密度和質(zhì)量。當(dāng)離心機(jī)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)時(shí)這些顆粒在介質(zhì)中發(fā)生沉降或漂浮，它的沉降速度與作用在顆粒上的力的大小和力的方向有關(guān)。顆粒除受到離心力(F_c)外，還受到顆粒在介質(zhì)中移動(dòng)時(shí)的摩擦阻力(F_f)、與離心力方向相反的浮力(F_B)、顆粒處于重力場(chǎng)之下的重力(F_g)和與重力方向相反的浮力(F_b)。各力的作用方向見(jiàn)圖4—1。此外，顆粒還受到周?chē)橘|(zhì)小分子的作用力，當(dāng)顆粒很小時(shí)，介質(zhì)分子對(duì)顆粒的作用力十分明顯，要使這種小顆粒沉降，需要更大的離心力。本節(jié)只討論比介質(zhì)分子大得多的顆粒，因此介質(zhì)作用力不予考慮。下面將對(duì)各個(gè)力作詳細(xì)的分析湘儀離心機(jī)

  1）離心力

  離心力(F_c)的大小等于離心加速度ω²R與顆粒質(zhì)量m的乘積，即：

  F_c＝mω²R　　　　(4–1)

  其中ω是旋轉(zhuǎn)角速度（弧度/秒）,R是顆粒離旋轉(zhuǎn)中心的距離（cm），m是質(zhì)量（克）。

  2）重力

  重力(F_g)是顆粒質(zhì)量與重力加速度的乘積用下式表示：

  F_g＝mg　　　　 (4–2)

  重力的方向與離心力的方向互相垂直，同離心力相比顯得十分小，可以忽略不計(jì)。例如：離開(kāi)旋轉(zhuǎn)中心12cm的顆粒，在N＝1,000轉(zhuǎn)/分時(shí)離心，產(chǎn)生的離心力比重力大134倍。因?yàn)椋?/span>

  F_c/F_g＝mω²R/mg＝ω²R/g＝(2πN/60)²R/980＝(2×3.1416×1000/60)²×12/980＝134

  如在超速離心機(jī)中進(jìn)行離心分離，其離心力更大，重力更可以忽略不計(jì)。同時(shí)顆粒由重力而產(chǎn)生的浮力(F_b)也可忽略不計(jì)。

  3）介質(zhì)的摩擦阻力

  介質(zhì)對(duì)顆粒的摩擦阻力(F_f)用Stocke阻力方程表示：

  F_f＝6πηr_pdR/dt              （4–3）

  其中η是介質(zhì)的粘滯系數(shù)(厘泊，cP)；r_p是顆粒的半徑(cm)；dR/dt是顆粒在介質(zhì)中的移動(dòng)速度(cm/s)，又稱(chēng)為沉降速度，即單位時(shí)間內(nèi)顆粒沉降的距離。上述方程只適用于球形顆粒，但不少生物顆粒并非球形，有橢球形、扁球形、棒形或線形等，這使情況更復(fù)雜。對(duì)于橢球形顆粒的

  Stocke阻力方程應(yīng)改寫(xiě)成為：

  F_f＝6πηr_p(dR/dt)f/f₀           （4–4）

  其中f₀為球形摩擦系數(shù)，f為同球形等體積的扁球形或橢球形的摩擦系數(shù)。從f/f₀可以得出，顆粒偏離球形程度越大，f越大，則阻力F_f值也越大。

  4）浮力

  在重力場(chǎng)中，浮力的定義是指被物體所排開(kāi)周?chē)橘|(zhì)的重量。但在離心場(chǎng)的情況下，顆粒的浮力與離心力方向相反，為顆粒排開(kāi)介質(zhì)的質(zhì)量與離心加速度之乘積。用下式表示：

  F_B＝P_m(m/P_p)ω²R＝P_m/P_pmω²R   （4–5）

  其中P_p為顆粒密度(g/cm³)，P_m為介質(zhì)密度(g/cm³)，m/P_p為介質(zhì)的體積，Pm (m/P_p)為顆粒排開(kāi)介質(zhì)的質(zhì)量。

  綜上所述，在離心場(chǎng)中，作用于顆粒上的力主要有離心力F_c、浮力F_B和摩擦阻力F_f。當(dāng)離心轉(zhuǎn)子從靜止?fàn)顟B(tài)加速旋轉(zhuǎn)時(shí)，原來(lái)處于懸浮狀態(tài)的顆粒如果密度大于周?chē)橘|(zhì)的密度，則顆粒離開(kāi)軸心方向移動(dòng)，即發(fā)生沉降；如果顆粒密度低于周?chē)橘|(zhì)的密度，則顆粒朝向軸心方向移動(dòng)，即發(fā)生漂浮。無(wú)論沉降或漂浮，離心力的方向與摩擦阻力和浮力方向相反；當(dāng)離心力增大時(shí)，反向的兩個(gè)力也增大，到最后離心力與摩擦阻力和浮力平衡，顆粒的沉降(或漂浮速度)達(dá)到某一極限速度，這時(shí)顆粒運(yùn)動(dòng)的加速度等于零，速度dx/dt變成恒速運(yùn)動(dòng)。那么

  F_c＝F_B＋F_f                    （4–6）

  將式4–1，4–3，4–5代入式4–6得

  mω²R＝6πηr_pdR/dt＋(P_m/P_p)mω²R （4–7）

  其中球形體積V為4πr_p³/3，m＝VP_p＝(4πr³p/3)P_p故4–7式可寫(xiě)成：

  (4πr_p³/3)(P_p)(ω²R)＝6πηr_pdR/dt＋(4πr³/3)(P_p)(ω²R)

  整理后得：

  dR/dt＝4r_p² (P_p－P_m)/18ηω²R    （4–8）

  或者：

  V＝dR/dt＝d²(P_p－P_m)18ηω²R   （4–9）

  上式d為顆粒直徑(厘米)，對(duì)于非球形顆粒還應(yīng)考慮f/f₀的摩擦系數(shù)比，得：

  dR/dt＝d²(P_p－P_m)/(18ηf/f₀)ω²R （4–10）

  從式4–10可見(jiàn)：①顆粒的沉降速度與顆粒直徑的平方、顆粒與介質(zhì)的密度差和離心加速度成正比，而與介質(zhì)的粘滯度、顆粒偏離球形的程度成反比；②當(dāng)顆粒的密度P_p大于介質(zhì)密度P_m顆粒發(fā)生沉降；當(dāng)P_p＜P_m時(shí)，顆粒漂浮；當(dāng)P_p＝P_m時(shí)，顆粒不沉不??；③在離心加速度ω²R不變的情況下，顆粒的沉降速度主要決定于顆粒的直徑大小和顆粒的形狀，而顆粒的密度所起的作用較小。

  2、沉降系數(shù)

  1924年，Svedberg定義沉降系數(shù)為顆粒在單位離心力場(chǎng)作用下的沉降速度。即：

  S＝(dR/dt)/ω²R                     （4–11）

  沉降系數(shù)的物理意義是顆粒在離心力作用下從靜止?fàn)顟B(tài)到達(dá)極限速度所經(jīng)過(guò)的時(shí)間。沉降系數(shù)的單位用svedberg表示，量綱為秒，1 svednerg＝10^-13秒，簡(jiǎn)稱(chēng)S。

  將式4–10二邊同除以ω²R，得到沉降系數(shù)的表示式：

  S＝(dR/dt)/ω²R＝d²(P_p－P_m)/(18ηf/f₀)    （4–12）

  從上式可知：在給定的介質(zhì)中沉降系數(shù)的大小主要是由顆粒直徑的平方和摩擦系數(shù)f/f₀所決定。

  3、相對(duì)離心力和離心時(shí)間

  1）相對(duì)離心力(RCF)：是指在離心力場(chǎng)中，作用于顆粒的離心力相當(dāng)于地球引力的倍數(shù)。重力加速度g=980厘米/秒²。故RCF的公式如下：

  RCF＝Fc/F_g＝mω²R/mg＝ω²R/g

  ＝(2πrpm/60)²R/980＝1.118×10^-5R(rpm)²

  如以N代表rpm，同上式可轉(zhuǎn)化為：

  RCF＝1.118×10^-5RN²                 （4–13）

  其中R為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離（cm），N為轉(zhuǎn)速（轉(zhuǎn)/分）。

  一般情況下，低速離心時(shí)常以rpm來(lái)表示，超速離心則以g表示。計(jì)算顆粒的相對(duì)離心力時(shí)，應(yīng)注意離心管與旋轉(zhuǎn)中心的距離R。由于轉(zhuǎn)子的形狀及設(shè)計(jì)差異，離心管的口部和底部到旋轉(zhuǎn)軸中心距離差異很大。如：離心管口R＝4.8厘米，管底R＝8.0厘米，rpm＝12000

  RCF_口部＝1.118×10^-5×(12000)²×4.8＝7737×g

  RCF_底部＝1.118×10^-5×(12000)²×8.0＝12891×g

  由此所見(jiàn)，作用于離心管口部和底部的離心力相差近乎一倍。這不僅說(shuō)明了超速離心時(shí)用g代替rpm的原因，也說(shuō)明了R應(yīng)指旋轉(zhuǎn)軸中心到某被分離物質(zhì)顆粒在離心管中所處位置的距離，該顆粒所受到離心力隨其在管中的移動(dòng)而變化?？萍嘉墨I(xiàn)中，離心力的數(shù)據(jù)常指其平均值，即離心管中點(diǎn)的離心力。

  為了便于進(jìn)行轉(zhuǎn)速和相對(duì)離心力之間的換算，Dole和Cotzias在式4–13的基礎(chǔ)上制作了三者關(guān)系的列線計(jì)算圖4–2，圖示法較公式法計(jì)算方便。已知離心轉(zhuǎn)子的半徑、轉(zhuǎn)速和相對(duì)離心力中的任意兩個(gè)數(shù)值，可以求得第三個(gè)數(shù)值。在列線計(jì)算圖中找到兩數(shù)值對(duì)應(yīng)的點(diǎn)位置，過(guò)兩點(diǎn)作直線，直線與第三條列線相交，交點(diǎn)的數(shù)值即為所求第三者的值。

  2）沉降時(shí)間(t)：在某一個(gè)介質(zhì)中使一種球形顆粒從液體的彎月面沉降到離心管底部所需要的離心時(shí)間。沉降時(shí)間與沉降速度成反比。

  t＝18η/[ω²d²(P_p－P_m)]ln(R_max/R_min)          （4—14）

  
  Rmax和Rmin分別代表轉(zhuǎn)軸中心至離心管底部和液面的距離。

  如果已知某種顆粒的沉降系數(shù)(S)，則可估計(jì)其沉降時(shí)間(t)

  t＝1/S［(lnR_max－1nR_min)/ω²］                （4—15）

  離心時(shí)間是由實(shí)驗(yàn)要求所決定，為了避免不穩(wěn)定顆粒的凝聚、擠壓損傷或變性失活，并使擴(kuò)散所導(dǎo)致的區(qū)帶加寬現(xiàn)象減弱，在保證分離的前提下，應(yīng)盡可能縮短離心時(shí)間。相反，分離某些沉降較快的大顆粒時(shí)，為了達(dá)到預(yù)期的分離效果，往往使用粘度較大的梯度，以阻止顆粒的過(guò)度沉降，并延長(zhǎng)離心時(shí)間。

  4、離心機(jī)的分類(lèi)

  目前在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域內(nèi)常用的離心機(jī)種類(lèi)繁多，按其離心轉(zhuǎn)子能達(dá)到最高轉(zhuǎn)速分類(lèi)有：低速離心機(jī)(在6,000rpm以下)、高速離心機(jī)(在25,000rpm以下)和超速離心機(jī)(在30,000rpm以上)。目前商售大型超高速離心機(jī)最高轉(zhuǎn)速達(dá)100,000rpm，相對(duì)離心力803000×g。在超速離心機(jī)中，根據(jù)用途不同，又可分為制備型超速離心機(jī)、分析型超速離心機(jī)及制備分析兩用型超速離心機(jī)。近年制備型與分析型界限在逐步消失，出現(xiàn)制備分析兩用機(jī)，通過(guò)更換轉(zhuǎn)子和裝上光學(xué)附件進(jìn)行分析工作。用制備型的區(qū)帶轉(zhuǎn)子或水平轉(zhuǎn)子，運(yùn)用密度技術(shù)可測(cè)定顆粒沉降系數(shù)、病毒或核酸的浮力密度，部分代替了分析型超速離心機(jī)功能。

  表4—1  三種不同級(jí)別的制備離心機(jī)的比較

  類(lèi)型	普通離心機(jī)	高速離心機(jī)	超速離心機(jī)
  最大轉(zhuǎn)速(rpm)	6,000	25,000	30,000以上
  最大RCF(g)	6,000	89,000	可達(dá)510,000以上
  分離形式	差速離心	差速離心	密度梯度區(qū)帶分離 或差速沉降分離
  離心管平衡 允許誤差	0.25克	0.1克	0.1克
  轉(zhuǎn)子	角式和外擺式轉(zhuǎn)子	角式，外擺式轉(zhuǎn)子等	角式，外擺式，區(qū)帶轉(zhuǎn)子等
  儀器結(jié)構(gòu)、 性能和特點(diǎn)	速度控制不嚴(yán)格，多數(shù)室溫下操作	有致冷裝置，有較準(zhǔn)確速度和溫度控制系統(tǒng)	有真空和冷卻系統(tǒng)，精確的溫度和速度控制、監(jiān)測(cè)系統(tǒng)，保證轉(zhuǎn)子正常運(yùn)轉(zhuǎn)的傳動(dòng)和制動(dòng)裝置。
  應(yīng)用	收集易沉降的大顆粒(如RBC，酵母細(xì)胞等)	收集微生物、細(xì)胞碎片、大細(xì)胞、硫酸銨沉淀物和免疫沉淀物等。但不能有效沉淀病毒、小細(xì)胞器(如核糖體)、蛋白質(zhì)等大分子	主要分離細(xì)胞器，病毒，核酸蛋白質(zhì)，多糖等甚至能分開(kāi)分子量相近的同位素標(biāo)記物15N—DNA和未標(biāo)記的DNA

  二、離心分離的種類(lèi)

  根據(jù)離心原理，可設(shè)計(jì)出各種離心方法，歸納起來(lái)有二大類(lèi)(表4–2)。分析型超速離心方法在這里我們不予討論。

  表4–2離心分離法的分類(lèi)

  離心方法	差速離心	密度梯度區(qū)帶離心
  		速度區(qū)帶離心	等密度離心
  顆粒沉降系數(shù)	相差大(1~n個(gè)數(shù)量級(jí))	相差較少(2％或更少)?；蚍肿恿肯嗖?/span>3倍的蛋白質(zhì)
  離心特點(diǎn)	短時(shí)間、多次采用不同速度和離心時(shí)間進(jìn)行分段離心	①沉降速度主要依賴于顆粒的形狀和大小②離心時(shí)間較短，顆粒沉降速度不可能為零，若時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，分離開(kāi)的區(qū)帶有可能在管底重新靠擾③顆粒密度不等于周?chē)橘|(zhì)密度	①沉降平衡主要依賴于顆粒的密度②離心時(shí)間較長(zhǎng)，一般大于15h，平衡時(shí)沉降速度為零，形成穩(wěn)定的區(qū)帶③沉降平衡時(shí)，顆粒密度一定等于周?chē)橘|(zhì)的密度
  適用范圍	分子量(或大小)相差大，不穩(wěn)定，易變性、易受梯度介質(zhì)損傷的顆粒。常用于從組織勻漿中分離細(xì)胞器及分離病毒	大小不同而密度相似，受差速離心擠壓變形，受低濃度梯度介質(zhì)損傷較少的顆粒。一次分離量較少，宜作分析分離。可分離核酸、蛋白質(zhì)、核糖體亞基及其它成份(如整細(xì)胞、脂蛋白)	大小相同而密度不同，穩(wěn)定、不受高濃度介質(zhì)損傷的顆粒。一次分離樣品量大，用于制備及分析分離?？煞蛛x核酸、亞細(xì)胞器、整細(xì)胞，也可分離復(fù)合蛋白質(zhì)，但簡(jiǎn)單蛋白質(zhì)不適用

  1、差速離心法

  差速離心法是指通過(guò)不斷增加相對(duì)離心力，使沉降速度不同的顆粒，在不同離心速度及不同離心時(shí)間下分批離心方法。差速離心法一般用于分離沉降系數(shù)相差較大的顆粒。

  進(jìn)行差速離心時(shí)，首先要選擇好顆粒沉降所需要的離心力和離心時(shí)間。離心力過(guò)大或離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，容易導(dǎo)致大部分或全部顆粒沉降及顆粒被擠壓損傷。當(dāng)一定離心力在一定的離心時(shí)間內(nèi)進(jìn)行離心時(shí)，在離心管底部就會(huì)得到最大和最重顆粒的沉淀，分出的上清液進(jìn)一步加大轉(zhuǎn)速再次進(jìn)行離心，又得到第二部分較大、較重顆粒的“沉淀”及含更小更輕顆粒的“上清液”。如此多次離心處理，即能把流體中的不同顆粒較好地分離開(kāi)，此法所得沉淀是不均一的，仍雜有其它成份，需經(jīng)再懸浮和再離心(2~3次)，才能得到較純的顆粒。

  差速離心法主要用于分離細(xì)胞器和病毒。其優(yōu)點(diǎn)是：操作簡(jiǎn)單，離心后用傾倒法即可將上清液與沉淀分開(kāi)，并可使用容量較大的角式轉(zhuǎn)子；缺點(diǎn)是：(1)分離效果差，不能一次得到純顆粒。(2)管壁效應(yīng)嚴(yán)重。特別當(dāng)顆粒很大或濃度很高時(shí)，在離心管一側(cè)會(huì)出現(xiàn)沉淀。(3)顆粒被擠壓，離心力過(guò)大，離心時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)使顆粒變形、聚集而失活。差速離心的分辨率不高，沉降系數(shù)在同一個(gè)數(shù)量級(jí)內(nèi)的各種顆粒不容易分開(kāi)，它常用于其他分離手段之前的粗制品提取。各種顆粒的沉降速度遵循式4—10。顆粒愈大，沉降速度也愈大，離心后沉淀到離心和底部所需的時(shí)間愈短。

  1、密度梯度離心法

  密度梯度離心法包括速度區(qū)帶和等密度離心二種方法。后者又可分為預(yù)制梯度等密度及自形成梯度等密度兩種方法，現(xiàn)分別敘述如下：

  1）速度區(qū)帶離心法

  速度區(qū)帶離心法是在離心前離心管內(nèi)先裝入密度梯度介質(zhì)(如蔗糖、甘油、KBr、CsCl等)，待分離的樣品鋪在梯度液的頂部或梯度層中間，同梯度液一起離心。由于離心力的作用，顆粒離開(kāi)原樣品層，按不同沉降速度向管底沉降，離心一定時(shí)間后，沉降的顆粒逐漸分開(kāi)，最后形成一系列界面清楚的不連續(xù)區(qū)帶。沉降系數(shù)越大，往下沉降越快，所呈的區(qū)帶也越低。沉降系數(shù)較小的顆粒，則在較上部分依次出現(xiàn)。在離心過(guò)程中，區(qū)帶的位置和形狀(或?qū)挾?/span>)隨時(shí)間而改變，因此區(qū)帶的寬度不僅取決于樣品組分的數(shù)量、梯度的斜率、顆粒的擴(kuò)散作用和均一性，也與離心時(shí)間有關(guān)。時(shí)間越長(zhǎng)，區(qū)帶越寬，適當(dāng)增加離心力可縮短離心時(shí)間，并減少擴(kuò)散所導(dǎo)致的區(qū)帶加寬現(xiàn)象，增加區(qū)帶面的穩(wěn)定性。

  歸納起來(lái)有兩種密度梯度液，一種密度隨管長(zhǎng)或半徑呈階梯式增加，為不連續(xù)梯度。另一種是密度隨管長(zhǎng)或半徑逐漸增加為連續(xù)梯度。

  不連續(xù)密度梯度制備：通常先配好一系列不同密度的溶液，然后用移液管將梯度介質(zhì)由濃到稀沿管壁小心加入，或用一加細(xì)管的注射器針頭插到管底，從稀到濃一層層地鋪到離心管中，即可產(chǎn)生一個(gè)不連續(xù)的密度梯度。

  連續(xù)密度梯度制備：最簡(jiǎn)單的設(shè)備包括兩個(gè)柱形的容器。中間裝一連通管，連通管上安裝有活塞開(kāi)關(guān)，兩邊為儲(chǔ)存室和混合室，后者內(nèi)裝有攪拌器，通過(guò)導(dǎo)液管使混合液流入離心管中。離心管頂部和底部所需要的兩種不同密度溶液，分別裝入儲(chǔ)存室和混合室內(nèi)。將較濃的溶液放在混合室中，較稀的溶液放在儲(chǔ)存室中。開(kāi)動(dòng)攪拌器，打開(kāi)接通管活塞，控制流速。導(dǎo)液管口必須緊貼離心管壁，(或?qū)б汗芸诓宓焦艿撞课徊⑽挥谄渲行?/span>)，因?yàn)檫@樣從混合室中流出蔗糖溶液的濃度以線性速率減低，使溶液沿離心管壁流下，可以避免擾亂已形成的密度梯度。

  2）等密度離心法

  某些密度梯度介質(zhì)經(jīng)過(guò)離心后會(huì)自身形成梯度，如Percoll則可迅速形成梯度，CsCl、Cs₂SO₄和三碘苯甲酰葡萄糖胺經(jīng)長(zhǎng)時(shí)間離心后也可產(chǎn)生穩(wěn)定的梯度。需要離心分離的樣品可和梯度介質(zhì)先均勻混合，梯度介質(zhì)由于離心力的作用逐漸形成管底部濃而管頂稀的密度梯度，與此同時(shí)原來(lái)分布均勻的顆粒也發(fā)生重新分布。當(dāng)管底介質(zhì)的密度大于顆粒的密度即ρ_m＞ρ_p時(shí)，顆粒上??；當(dāng)管頂介質(zhì)的密度小于顆粒的密度即ρ_p＞ρ_m時(shí)，則顆粒沉降；最后顆粒進(jìn)入到一個(gè)它本身的密度位置即ρ_p＝ρ_m，顆粒不再移動(dòng)，形成穩(wěn)定的區(qū)帶。等密度離心法需時(shí)間較長(zhǎng)，一般為十幾小時(shí)至幾十小時(shí)。

  梯度材料的選擇原則  ①對(duì)被分離的生物樣品無(wú)作用，不會(huì)使生物樣品失活；②在溶液中穩(wěn)定，在離心作用下不會(huì)解離或聚合；③在使用的密度范圍中，粘度低，滲透壓小，離子強(qiáng)度及pH值變化??；④易與被分離的顆粒分開(kāi)；⑤不會(huì)對(duì)離心機(jī)設(shè)備發(fā)生腐蝕作用；⑥便于濃度測(cè)定等等。這些原則當(dāng)然比較理想，完全符合每種性能的梯度材料幾乎是沒(méi)有的。下面介紹幾種基本上符合上述原則的梯度材料：

  (1)糖類(lèi)：蔗糖、甘油、聚蔗糖(ficoll)、右旋糖酐、糖原等。

  (2)無(wú)機(jī)鹽類(lèi)：CsCl(氯化銫)、RbCl(氯化銣)、NaCl、KBr等。

  (3)有機(jī)碘化物：三磺苯甲酰葡萄糖胺(martizamide)等。

  (4)硅溶膠：Ludox的各種類(lèi)型，如Percoll。

  梯度液的收集  離心后顆粒在梯度液中分層，小心取出離心管，防止振搖以避免分層的

  顆?；旌?。收集梯度液中顆粒的方法很多，有管底穿孔計(jì)滴法、插管虹吸計(jì)滴法，濃液頂替法和注射器穿孔抽取法等。

  3、離心轉(zhuǎn)頭的種類(lèi)

  超速離心機(jī)主要由四個(gè)部分組成：(1)轉(zhuǎn)子；(2)驅(qū)動(dòng)和速度控制部分；(3)溫度控制系統(tǒng)；(4)真空系統(tǒng)。其結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是有完善的冷卻和真空系統(tǒng)，以消除摩擦熱，保護(hù)轉(zhuǎn)子和離心樣品。高速離心機(jī)沒(méi)有真空系統(tǒng)。

  制備超速離心機(jī)常用的離心轉(zhuǎn)子有三種：①固定角度轉(zhuǎn)子(fixed-angle rotor)；②水平轉(zhuǎn)子(swing-out rotor或swing-backet rotor)；③垂直轉(zhuǎn)子(vertical rotor)。這三種轉(zhuǎn)子的性能及用途有一定差異，正確選擇轉(zhuǎn)子有利于獲得良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

  固定角度轉(zhuǎn)子：離心管放置的位置與旋轉(zhuǎn)軸心形成固定角度。角度范圍在14°~40°之間。

  水平轉(zhuǎn)子：開(kāi)始處于垂直方向的離心管由于離心時(shí)轉(zhuǎn)子高速旋轉(zhuǎn)，受離心力作用，盛離心管的吊桶(backets)，使離心管甩成水平方向，顆粒的沉淀方向同旋轉(zhuǎn)半徑方向基本一致。

  垂直轉(zhuǎn)子：離心管與旋轉(zhuǎn)軸心成0角度。

  轉(zhuǎn)子都有一定的使用速度和使用限度，任何轉(zhuǎn)子都不允許在滿額或超額轉(zhuǎn)速下運(yùn)轉(zhuǎn)，有人建議使用轉(zhuǎn)速為最大額定速的75％，以保證安全，延長(zhǎng)使用壽命。隨著使用時(shí)間和次數(shù)的增加，轉(zhuǎn)子長(zhǎng)期疲勞必然引起運(yùn)轉(zhuǎn)額定速度下降。所以使用轉(zhuǎn)子時(shí)，必須設(shè)立檔案，記錄每次的使用時(shí)間，一定時(shí)間或次數(shù)后，應(yīng)重新估算其最大允許速度，以保障使用安全。各制造廠和生產(chǎn)的轉(zhuǎn)子均已標(biāo)明其保證在最大轉(zhuǎn)速下使用1,000次或2,500小時(shí)或5年，此后轉(zhuǎn)速降低10％后又能再用1,000次或2,500小時(shí)。

  轉(zhuǎn)子通常用(鋁)合金、鋁(鎳)合金或塑料制成。塑料轉(zhuǎn)子(如聚氯苯，聚四氟乙烯)的固有弱點(diǎn)是強(qiáng)度低，使用速度僅限于6,000rpm以下；鋁合金具有輕便、價(jià)廉、易加工、有一定強(qiáng)度和抗暴性能等優(yōu)點(diǎn)。但不能加熱消毒，易氧化，抗化學(xué)腐蝕性差，此外，抗金屬疲勞損傷的性能也差。鈦合金轉(zhuǎn)子雖然價(jià)格昂貴，加工困難，內(nèi)含的銅可能抑制一些酶的活性，也比較笨重，但它強(qiáng)度大，耐用，能經(jīng)受冷凍及高溫消毒處理，抗化學(xué)腐蝕和應(yīng)變侵蝕的性能強(qiáng)，是當(dāng)前最理想的轉(zhuǎn)子。

  實(shí)驗(yàn)十一  血漿HDL-Ch含量的測(cè)定(肝素-Mn法)

  目的

  1、掌握測(cè)定血漿HDL—膽固醇的原理及方法

  2、了解血漿HDL—膽固醇臨床意義，進(jìn)一步加深對(duì)脂蛋白結(jié)構(gòu)與代謝有關(guān)內(nèi)容的理解

  原理

  高密度脂蛋白是血漿脂蛋白的一種，起初由肝臟和小腸合成，分泌至血液循環(huán)時(shí)呈圓盤(pán)狀稱(chēng)為新生HDL。在循環(huán)中或組織細(xì)胞中LCAT(磷脂酰膽堿—膽固醇脂?；D(zhuǎn)移酶)的催化下，新生的HDL與其它脂蛋白相互作用，使顆粒表面的膽固醇接受磷脂轉(zhuǎn)移酶轉(zhuǎn)移來(lái)的脂酸轉(zhuǎn)變?yōu)槟懝檀减ィ朔菢O性的膽固醇酯進(jìn)入疏水核心，使盤(pán)狀的HDL逐漸轉(zhuǎn)變成球形的成熟的HDL。HDL不僅能與其它脂蛋白互相作用轉(zhuǎn)移其組成成分，而且能將組織細(xì)胞的膽固醇運(yùn)輸?shù)礁闻K而排泄(或變成膽酸而排泄)。HDL是由蛋白質(zhì)、磷酯、膽固醇、甘油三酯按一定比例組成的。大量流行病學(xué)研究表明，血漿HDL水平與冠心病的發(fā)病率呈負(fù)相關(guān)，高水平HDL有利于預(yù)防冠心病的發(fā)生。

  一定濃度的肝素—Mn混合液在一定條件下可選擇性地使血漿中VLDL及LDL沉淀起來(lái)，而HDL仍留在上清液中，從而使HDL與LDL及VLDL分開(kāi)。HDL中含有一定的膽固醇。利用膽固醇的類(lèi)脂性質(zhì)，可用有機(jī)溶劑進(jìn)行抽提，然后取一定量抽提液蒸干，加入冰醋酸，利用Zak氏三氯化鐵顯色法，使溶解于冰醋酸中的膽固醇在硫酸存在的條件下與高鐵離子作用，產(chǎn)生穩(wěn)定的紅色物質(zhì)。此物質(zhì)在560nm波長(zhǎng)有最大吸收，可作定量分析。

  試劑

  1、標(biāo)準(zhǔn)膽固醇液：

  a. 貯存液(1000μg/ml)：準(zhǔn)確稱(chēng)取膽固醇標(biāo)準(zhǔn)100mg溶于100ml三氯化鐵冰醋酸溶液中。

  b. 應(yīng)用液：(80μg/ml)：取貯存液4ml加三氯化鐵冰醋酸至50ml。

  2、三氯化鐵冰醋溶液：

  a. 貯存液(125mg/ml)：取1.25克三氯化鐵溶于100ml冰醋酸中

  b. 應(yīng)用液(1mg/ml)：取貯存液2ml加冰醋酸至250ml

  3、濃H₂SO₄(要求AR)

  4、丙酮—乙醇混合液(按1：1比例配制V/V)

  5、肝素—Mn混合液

  a. 1.06mol/L氯化錳液(MnCl₂·4H₂O，MW198)：取209.9克MnCl₂·4H₂O溶于1000mlH₂O中

  b. 肝素液(280mg/ml)：取肝素280mg溶于1.0ml水溶液中。

  c. 肝素—Mn混合液：取a液10ml＋b液0.6ml混勻即成。

  臨用前配制，放冰箱保存，至多用一個(gè)月。

  操作

  1、HDL的分離

  取干燥離心管一支，取0.5ml血漿加肝素—Mn混合液0.05ml，混勻后室溫靜置10min。 3000轉(zhuǎn)/分離心10min。沉淀部分為VLDL和LDL，而HDL存在于上清液中。

  2、HDL—膽固醇的提取(有機(jī)溶劑抽提法)

  取肝素—Mn沉淀后的上清液0.1ml，加酮醇混合液2.5ml(快速加入，使沉淀均勻)，3000 轉(zhuǎn)/分離心5~6min。取上清液2 ml于沸水中蒸干，此為樣品管(沉淀部分為蛋白質(zhì))。

  3、膽固醇測(cè)定取短試管三支，按下表操作，注意加H₂SO₄時(shí)需將試管斜置，沿管壁加入

  試劑(ml)管號(hào)	空  白	樣  品	標(biāo)準(zhǔn)(80μg/ml)
  三氯化鐵冰醋酸溶液	1.5	1.5	0.5
  標(biāo)準(zhǔn)膽固醇(ml)	—	—	1.0
  濃硫酸(ml)	1.0	1.0	1.0

  搖勻，60℃水浴10分鐘，560nm比色。記錄吸光度。

  計(jì)算公式：

  血清HDL—膽固醇(mg％)＝A_樣/A_標(biāo)×C_標(biāo)×K(mg/dl)

  K＝(0.5＋0.05)/0.5×(0.1＋2.5)/2×1/0.1×100/1000＝1.1×1.3＝1.43

  臨床意義及正常值：

  正常人血漿總膽固醇為125~200mg％，HDL中所含的膽固醇占總膽固醇的1/3~1/4，人們常用HDL中膽固醇的含量表示HDL的量。

  HDL—膽固醇水平愈高，愈有利于將組織中的膽固醇運(yùn)輸出來(lái)，對(duì)人們健康長(zhǎng)壽十分有益，

  長(zhǎng)期堅(jiān)持體育鍛煉者，其血漿HDL膽固醇較一般人為高，冠心病者比一般正常人低，臨床在測(cè)定血脂時(shí)也測(cè)定HDL—膽固醇的含量，對(duì)于診斷冠心病以及觀察治療效果有一定意義。

  實(shí)驗(yàn)十二  細(xì)胞器的分離和鑒定

  許多具有生物活性的生物大分子和亞細(xì)胞器很不穩(wěn)定，在分離過(guò)程中要求溫度低，操作溫和，不能應(yīng)用一般的化學(xué)分離方法，因此需用低溫高速離心法。如常用差速離心法分離亞細(xì)胞器、線粒體、微粒體和細(xì)胞核等，在分離亞細(xì)胞的過(guò)程中要注意盡可能地保存其原來(lái)活性和結(jié)構(gòu)形態(tài)。

  試劑：

  1、0.25mol/L蔗糖液100ml，pH7.5

  稱(chēng)取蔗糖8.6g溶于少量重蒸餾水，用1mol/LNaOH調(diào)整pH7.5，1mol/LNaOH的用量約0.75ml，再加蒸餾水至100ml即可。4℃可保存一周。

  2、MA液：4℃保存1~2周。

  0.25mol/L蔗糖液8.6g/100ml

  10mmol/L Tris-HCL液0.12g Tris/100ml用HCL調(diào)pH8.0(約1mol/L HCL0.215ml)

  3mMMgCl₂0.061g/100ml

  先配制Tris-HCL液，用該溶液溶解蔗糖和MgCl₂至100ml

  3、MB液：4℃保存1~2周

  配制同MA液，在MA溶液中加0.1ml Triton X-100/100ml

  4、MC液：4℃保存1~2周

  2.2mol/L蔗糖75.3g/100ml

  5、0.4mol/L KCl溶液：2.98g/100ml

  6、10％過(guò)氯酸(PCA)：取99.8％過(guò)氯酸100ml加水至100ml

  7、二苯胺—冰乙酸溶液：(新鮮配制)

  稱(chēng)二苯胺1.5g溶于100ml冰乙酸中，再加濃硫酸1.5ml

  8、1mol/L NaOH

  
  9、0.01％甲烯蘭溶液

  操作

  (一)細(xì)胞器的分離過(guò)程

  1、肝勻漿制備：將大鼠斷頭放血處死，迅速取出肝臟，用生理鹽水沖凈肝臟表面的血液，剔去結(jié)締組織，稱(chēng)取1.0克肝組織，剪碎放入盛有0.25mol/L蔗糖液3ml的Tefion-glass勻漿器內(nèi)，接上電動(dòng)馬達(dá)勻漿，直至無(wú)肉眼可見(jiàn)的組織殘塊，再把勻漿倒入離心管，用0.25mol/l蔗糖液2ml沖洗勻漿管，一并放入離心管。

  2、線粒體和細(xì)胞核的分離，按表操作。

  (二)細(xì)胞器的鑒定：

  1、線粒體的鑒定：在線粒體內(nèi)有由氧化還原酶類(lèi)組成的呼吸鏈，包括NADH氧化呼吸鏈和琥珀酸氧化呼吸鏈。在生理?xiàng)l件下，底物脫下的氫可經(jīng)呼吸鏈徹底氧化生成H₂O，并釋放出能量。

  但在體外可用甲烯蘭(MB)作為受氫體。MB按受H₂則變成甲烯白(MBH₂)，顏色由蘭色變白色。

  2、細(xì)胞核的鑒定：

  (1)顯微鏡觀察：用HE染色法，在鏡下觀察核的形態(tài)。

  (2)用Burten's法測(cè)定DNA濃度：DNA是細(xì)胞核內(nèi)的特征性物質(zhì)。各種動(dòng)物的細(xì)胞核所含的DNA量是十分恒定的，不受生理?xiàng)l件、環(huán)境因素等的影響。因此可用測(cè)定DNA含量來(lái)鑒定細(xì)胞核。

   

  取水解上清液1ml放入T管，取10％過(guò)氯酸1ml放入B管，分別加二苯胺液4ml于T、B管中搖勻后，置80℃水浴10min，取出冷卻后，在分光光度計(jì)上(600nm)測(cè)吸光度，查標(biāo)準(zhǔn)曲線或用標(biāo)準(zhǔn)管直接計(jì)算。

  
  
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